Illumina solexa测序

Solexa测序技术第二代分析系统Genome Analyzer IIx是当前世界上应用最为广泛的新一代测序系统，较当前普遍使用的一次只能读取1,000个左右的碱基，且DNA样品需要长时间的制备和分析的测序仪，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势。可以同时完成传统基因组学研究以及功能基因组学研究。为目前遗传分析和功能基因组等研究领域提出了全新的应用方案。

Genome Analyzer IIx测序读长为75×2 bp，每次运行数据量达14~18GB。对于4~5Mb的基因组，可确保每个基因组测序量达到400Mb（~100X覆盖），足以满足全基因组de novo测序和SNP鉴定的需要。

Solexa 高通量测序原理 

Solexa 方法是利用单分子阵列测 试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上， 经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定 在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和 聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基 的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发 结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合， 检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。 

Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种 核苷的标签，采用边合成边测序（SBS － sequencing by synthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品 量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少 （只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。 

实验流程

1. 文库制备
将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。

2. 产生DNA簇
利 用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）随机和附近 的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥 (bridge) “。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇 产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。
 
3. 测序
Genome Analyzer 系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 这些核苷 酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所 聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统 计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长 会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。
 
4. 数据分析
自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析

Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ）的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（ SBS －sequencing by synthesis ），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 ,因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。

随着 DNA 测序表达谱产品（ DNA sequencing ,expression_r profiling ）以及 microRNA 分析平台-Solexa Genome Analysis System. 相继问世，使得此种方法在更多的领域得到应用。
Illumina公司的Solexa测序技术为广大用户提供了强大的下一代测序方法，为目前遗传分析和功能基因组等热门研究领域的部分热门课题提出了全新的应用方案。

测序与重测序

无论您需要测定的是整个基因组的序列还是基因组上一个大片断候选区域的序列， Illumina Genome Analyzer系统都是当今世界上最先进、最经济的平台。Solexa测序技术和可逆中止化合物染料（reversible terminator chemistry）奠定了在下一代测序技术中高质量、高通量、低成本数据产出的基础。

表达谱分析
通过对样本中数以百万计的cDNA标签同时进行序列测定，Genome Analyzer系统可以使您对整个转录组进行数字化的分析，而成本仅仅维持在与目前其他模拟化分析技术同样的水平。由于我们的技术无需利用任何转录子特异性杂交探针，您可以同时进行全基因组转录子的发掘与定量分析，而无需事先知道基因组的注释情况。

小RNA鉴定与定量分析
Solexa测序技术可以提供一套全新独特的，适用于各个物种的小RNA深度鉴定与定量分析研究平台。通过大量的平行测序，研究人员可以发掘、鉴定并定量出任何物种全基因组水平的小RNA图谱。应用这种低成本快速测定数百万标签序列的新方法，Illumina Genome Analyzer提供了解密小RNA图谱独一无二的方法。