转录组测序

转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。相对于传统芯片而言，转录组测序无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测，能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

Solexa测序技术第二代分析系统Genome Analyzer IIx是当前世界上应用最为广泛的新一代测序系统，较当前普遍使用的一次只能读取1,000个左右的碱基，且DNA样品需要长时间的制备和分析的测序仪，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势。可以同时完成传统基因组学研究以及功能基因组学研究。为目前遗传分析和功能基因组等研究领域提出了全新的应用方案。
Genome Analyzer IIx测序读长为75×2 bp，每次运行数据量达14~18GB。对于4~5Mb的基因组，可确保每个基因组测序量达到400Mb（~100X覆盖），足以满足全基因组de novo测序和SNP鉴定的需要。

 

 

实验流程

1. 文库制备
将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。

2. 产生DNA簇
利 用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）随机和附近 的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥 (bridge) “。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇 产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。

3. 测序
Genome Analyzer 系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 这些核苷 酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所 聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统 计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长 会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。

4. 数据分析
自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析

 

生物信息分析

1. 有参考基因组的转录组分析（Transcriptome analysis with reference genome）

1) 测序原始数据处理（质量剪切、污染序列去除等）
2) 短序列mapping至参考基因组序列
3) 基因功能注释
4) 基因结构分析
5) 可变剪切分析
6) 基因表达差异分析（不少于两个样品）
7) 预测新的基因

2. 无参考基因组转录组分析 （De novo Transcriptome Analysis）

 

1) 测序原始数据处理（质量剪切、污染序列去除等）
2) Contig和Unigene统计分析
3) Unigene功能注释（NR、GO 和KEGG等）
4) SNPs及SSR分析等
5) 基因表达差异分析（不少于两个样品）

送样要求

1. 动物、植物、微生物

1) 请提供总量大于2g的新鲜样品；植物材料应尽量选取幼嫩部位，避免过老的组织。
2) 采样后将样品立即用液氮速冻，保存于－80℃（保存期不超过1个月），送样时使用干冰运输（不超过72h）。
3) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
4) 样品保存期间切忌反复冻融。
5) 样品质量合格与否的判断标准：RNA提取后经变性电泳，各RNA条带清晰，比例适中，完整性好，无降解。
2. RNA

1) 请提供OD260/280介于1.8～2.2之间，浓度≥250ng/μl，总量≥40μg的总RNA，并确保RNA无降解，无污染；或提供浓度≥50ng/μl，总量≥400ng的mRNA。
2) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
3) 样品保存期间切忌反复冻融。
4) 送样时使用干冰运输。
5) 质检以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。
6) 请填写完整的送样订单，并提供RNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。
3. 双链cDNA

 

1) 总量＞5μg，浓度＞50ng/μl，OD260/280在1.8左右。
2) 送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。
3) 样品保存期间切忌反复冻融。
4) 送样时使用干冰或冰袋运输。
5) 请填写完整的送样订单，并提供cDNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样品一起送样。

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